血管內皮祖細胞逆轉骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性的研究

 

　　研究背景:絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性絕經后雌激素合成和分泌不足致使骨形成和骨吸收代謝失衡,骨丟失,骨密度降低造成的一種常見的全身性疾病。

 

　　研究證實雌激素水平降低是造成PMOP的重要原因,導致牙槽骨吸收加快,牙齒缺失,牙周組織的再生與修復困難。

 

　　近年來隨著骨組織工程的深入研究,應用骨髓間充質干細胞(BMSCs)修復頜骨、牙槽骨缺損取得了較大進展。

 

　　然而,國內外研究發現,雌激素缺乏的微環境會導致BMSCs凋亡增加以及骨向分化能力降低,此時依靠單純BMSCs植入來修復骨缺損,由于缺乏必要的營養支持和適宜的局部微環境,從而導致其生存能力降低。

 

　　綜上,應用干細胞移植方法來修復骨缺損能夠成功的關鍵是提高移植物中BMSCs的存活率并保持其干細胞的特性。

 

　　近年來研究發現EPCs具有特異性歸巢的能力,能通過自身的分化、增殖形成新生血管,對改善微環境具有獨特的優越性。

 

　　本實驗旨在通過建立血管內皮祖細胞(EPCs)與去勢大鼠骨髓間充質干細胞(OVX-BMSCs)transwell間接共培養體系,來探明EPCs是否能夠逆轉OVX-BMSCs的生物學特性,以奠定臨床骨質疏松患者牙槽骨修復的理論基礎。

 

　　研究目的:本實驗應用大鼠血管內皮祖細胞(EPCs)與去勢大鼠骨髓間充質干細胞(OVX-BMSCs)進行體外transwell間接共培養,觀察EPCs對OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化特性的影響,為臨床修復骨質疏松患者的牙槽骨缺損提供理論依據。

 

　　研究內容:(1)去勢大鼠骨質疏松模型的建立。

 

　　(2)假手術組和去勢組大鼠BMSCs的分離、培養及鑒定;假手術組大鼠EPCs的分離、培養及鑒定。

 

　　(3)在transwell間接共培養條件下,研究EPCs對OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化能力的影響。

 

　　研究方法:(1)建立去勢大鼠骨質疏松模型:造模的方法是選擇適合月齡(3月齡)的雌性大鼠,用10%水合氯醛經腹腔注射麻醉,選用背部雙側切口,鈍性分離進腹腔,沿輸卵管逆行確定卵巢位置后絲線結扎將其切除,結扎殘端、依次縫合切口。

 

　　假手術組僅切除卵巢周圍等量的脂肪組織。

 

　　術后3個月,采用micro-CT掃描股骨對大鼠模型進行評估。

 

　　(2)EPCs的分離培養:本實驗利用percoll淋巴細胞分離液經密度梯度離心獲取假手術組大鼠骨髓單個核細胞,通過差速貼壁結合特殊內皮細胞培養基擴增來誘導內皮細胞的分化,通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態,雙熒光免疫染色法檢測內皮細胞功能,應用流式細胞儀進行分子表型鑒定。

 

　　(3)BMSCs的分離培養:本實驗采用密度梯度離心法結合貼壁法來分離培養去勢組和假手術組大鼠BMSCs;于倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs細胞形態,應用流式細胞儀技術檢測分子表型,進行成骨成脂誘導進一步鑒定其干性。

 

　　(4)建立EPCs和OVX-BMSCs間接共培養體系并進行相關檢測:實驗組為EPCs和OVX-BMSCs以相同的密度分別接種于transwell底膜和6孔板底,并設置單純去勢組BMSCs和單純假手術組BMSCs接種作為2組對照組。

 

　　間接共培養條件下,利用流式細胞儀分別檢測實驗組和對照組BMSCs的增殖能力和凋亡率;ALP染色、茜素紅染色觀察三組BMSCs礦化結節的形成,Real-time PCR方法檢測三組BMSCs成骨基因的表達情況;油紅O染色觀察三組BMSCs脂滴形成情況,Real-time PCR方法檢測三組BMSCs成脂基因的表達。

 

　　研究結果:(1)去勢大鼠手術三個月后,micro-CT掃描結果顯示去勢組骨小梁排列明顯較假手術組稀疏,骨小梁密度減小,間隙增加。

 

　　分析兩組大鼠骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨表面積和骨體積比(BS/BV)顯示去勢組和假手術組相比兩者有顯著性差異(P<0.01),由此可證明本實驗中SD雌性大鼠去卵巢骨質疏松模型造模成功。

 

　　(2)本實驗中采用密度梯度離心法結合差速貼壁法,利用內皮細胞條件培養基誘導EPCs的生長,通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態,呈典型的“鋪路石”狀,應用流式細胞儀技術進行細胞表型鑒定,結果顯示細胞高表達造血干細胞和內皮細胞標志物,細胞雙熒光染色陽性,表明培養細胞為EPCs。

 

　　(3)本實驗中采用密度梯度離心法結合貼壁法分離培養BMSCs,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態呈長梭型,誘導細胞成骨、成脂分化,并且通過流式細胞儀檢測細胞表型,結果表明培養的細胞高表達間充質干細胞表面標記,幾乎不表達造血干細胞表面標記,表明培養的細胞為BMSCs。

 

　　(4)在間接共培養條件下,應用流式細胞儀檢測三組BMSCs的增殖能力和凋亡率,結果顯示EPCs與OVX-BMSCs間接共培養組的S期細胞數顯著大于去勢組BMSCs S期細胞數,且大于假手術組BMSCs S期細胞數(P<0.05);共培養組OVX-BMSCs細胞凋亡率顯著小于去勢組BMSCs凋亡率,且小于假手術組BMSCs凋亡率(P<0.05)。

 

　　ALP染色和茜素紅染色結果顯示共培養組OVX-BMSCs的礦化結節形成多于去勢組和假手術組,Real-time PCR檢測結果顯示共培養組OVX-BMSCs成骨基因Runx2、OCN、BSP的表達水平比去勢組BMSCs明顯上調,跟假手術組BMSCs相比也明顯上調(P<0.05)。

 

　　油紅O染色結果顯示共培養組OVX-BMSCs的脂滴形成多于去勢組和假手術組,Real-time PCR檢測結果顯示共培養組OVX-BMSCs成脂基因LPL、PPARγ2的表達水平比去勢組BMSCs明顯上調,跟假手術組BMSCs相比也明顯上調(P<0.05)。

 

　　結論:(1)選用3月齡SD雌性大鼠行雙側卵巢摘除,術后3個月micro-CT掃描結果及相關分析顯示成功建立去勢大鼠骨質疏松模型。

 

　　(2)間接共培養條件下,EPCs可逆轉OVX-BMSCs的增殖能力,降低其凋亡率。

 

　　(3)間接共培養條件下,EPCs可逆轉OVX-BMSCs的成骨分化能力,增強其成脂分化能力。