CKIP-1在炎癥介導下對增齡性骨髓間充質干細胞成骨作用研究
研究目的:骨質疏松癥是一種沉默性骨代謝疾病,表現為骨量的降低和骨結構的惡化,它可以顯著提高個體的骨折風險并給患者帶來沉重的經濟負擔,尤其對于65歲以上的老年人,嚴重的骨質疏松會導致骨折給患者帶來殘疾的風險。
骨重建中成骨前體細胞的主要來源是骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),對其進行調控可以影響成骨及成脂的分化。
CKIP-1是酪蛋白激酶相互作用蛋白1,它是成骨的負調控因子,敲除CKIP-1可導致Smurf1活性下降,MEKK2蛋白水平、磷酸化JNK及磷酸化c-Jun水平均上調,從而使JNK-AP-1通路活性上調,使成骨能力升高。
然而CKIP-1在MSCs調控骨分化方面的作用仍不清楚。
本實驗以CKIP-1基因敲除小鼠的骨量增加為入手點,首先探討增齡性小鼠的繁育性能及生長發育差異;其次,觀察了在體外培養的小鼠MSCs中CKIP-1基因缺失對干細胞的生物學特性影響,比較了小鼠體內及體外成骨差異;最后,初步研究了炎癥微環境條件下增齡性變化對CKIP-1的表達及體外成骨能力的影響,從而為骨質疏松癥的防治提供理論和實驗依據。
研究方法:1.建立CKIP-1基因敲除小鼠繁育體系,采用聚合酶鏈式反應(Polymerase chainreaction,PCR)技術對擴群子代小鼠基因型進行鑒定。
測定CKIP-1基因敲除小鼠與C57BL/6J野生型小鼠在繁育性能及體重,尾長的變化,分析基因敲除小鼠的生長發育情況。
2.采用全骨髓培養法分離培養WT(CKIP-1+/+)和KO(CKIP-1-/-)小鼠的MSCs,行MTT實驗及克隆實驗比較兩組小鼠MSCs的增殖能力,成骨實驗(茜素紅染色,ALP染色,實時定量PCR)、成脂實驗(油紅O染色)檢測兩組細胞的多向分化能力,流式細胞術鑒定MSCs表面標記分子。
3.采用Micro-CT機掃描并重建2月齡和18月齡的WT和KO小鼠股骨的骨小梁形態,觀察骨質影像學相關參數的差異,并分析骨含量的異同。
4.采用實時定量PCR技術、Western blot方法分別對2月齡和18月齡的C57BL/6J野生型小鼠進行體內和體外的CKIP-1表達,以研究CKIP-1在體內與體外的表達異同。
5.分別對2月齡和18月齡的C57BL/6J野生型小鼠注射IL-1β,采用實時定量PCR、Western blot檢測CKIP-1的表達差異,采用Micro-CT檢測兩組小鼠骨含量差異,初步探討CKIP-1與炎癥之間的關系。
結果:1.成功建立CKIP-1基因缺失小鼠的繁育體系,采用PCR擴增實驗進行基因鑒定,KO小鼠不表達CKIP-1結構中的3號外顯子,選取同窩同性別的WT及KO小鼠用于后續實驗。
兩組小鼠出生至第18個月,繁育性能和鼠尾長度并沒有明顯差異。
體重方面:從出生到第18個月,KO小鼠與WT小鼠體重在2月齡時無明顯差異(P>0.05),隨著年齡的增長,在第12月時WT小鼠的平均體重約為33g,而KO組小鼠的平均體重約為39g(P<0.05),到第18月時KO組小鼠的體重與WT組相差11g(P<0.05)。
2.利用小鼠股骨分離培養WT和KO小鼠的MSCs,KO小鼠的MSCs形態類似成纖維細胞樣,以長梭形為主,可形成均勻集落,流式細胞儀鑒定其高表達間充質來源細胞表面標記CD90、CD44、CD106。
使用KO及WT小鼠第三代(P3)細胞行體外成骨誘導,7天后行ALP染色,胞質內細胞顆粒增多,21天后行茜素紅染色,出現紅色陽性的礦化結節,胞質內充滿顆粒,細胞呈集落樣生長,細胞間有大量的礦化基質形成。
成骨誘導后,KO小鼠MSCs成骨能力強于WT(P<0.05)。
成骨誘導3天后,提取細胞總RNA,使用實時定量PCR檢測成骨、成脂相關基因的表達,KO組OCN、Runx2、PPAR-γ的表達較WT組均增多(P<0.05)。
成脂誘導21天后顯微鏡下觀察可見細胞立體感增強,細胞內出現小脂滴,細胞由長梭形變為圓形或多邊形排列,進行油紅O染色顯示有大量脂質沉淀,油紅O染色定量結果顯示,行成脂誘導后,KO組成脂能力強于WT組(P<0.05),且KO小鼠MSCs脂滴多于WT小鼠。
3.分別對2月齡和18月齡的WT及KO小鼠的股骨行Micro-CT掃描,結果顯示在2月齡小鼠中,WT組小鼠的骨體積分數(BV/TV)、特定骨表面積(BSA/BV)、骨小梁數目(TB.N)、骨小梁間隙(TB.Sp)與KO組小鼠無明顯差異(P>0.05),而在18月齡小鼠中,KO小鼠的骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目(TB.N)較WT小鼠增高(P<0.05),特定骨表面積(BSA/BV)、骨小梁間隙(TB.Sp)較WT小鼠降低(P<0.05)。
4.實時定量PCR及Western blot結果顯示在體外培養的2月齡和18月齡野生型小鼠MSCs中CKIP-1的表達無顯著性差異(P>0.05),行成骨誘導實驗后,CKIP-1在兩組中的表達亦無顯著性差異(P>0.05)。
但實時定量PCR顯示,CKIP-1在體內獲得的骨髓中的表達為18月齡的小鼠比2月齡小鼠高約4.3倍(P<0.05),Western blot顯示18月齡小鼠CKIP-1表達高于2月齡小鼠(P<0.05)。
5.從2月齡和18月齡野生型小鼠股骨中提取MSCs,在體外加入IL-1β后培養,實時定量PCR結果顯示,無論在2月齡還是18月齡小鼠組中,加入IL-1β均可增強CKIP-1的表達(P<0.05);同時,Western blot結果亦顯示加入IL-1β后,可增加CKIP-1的表達(P<0.05)。
為進一步觀察炎癥在小鼠體內是否影響CKIP-1的表達,我們對2月齡小鼠進行IL-1β腹腔注射,一周2次,對照組注射同等劑量PBS,3個月后取兩組小鼠的骨髓對CKIP-1表達進行分析,實時定量PCR結果顯示:IL-1β注射組的CKIP-1表達比對照組高3.2倍(P<0.05),Western blot結果顯示IL-1β注射組的CKIP-1表達比對照組高(P<0.05)。
Micro-CT結果顯示:IL-1β注射組小鼠的骨體積分數及骨密度較對照組為低(P<0.05)。
結論CKIP-1在骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化可能起到重要的調節作用,小鼠增齡性變化過程中炎癥可能會增強CKIP-1的表達,從而影響MSCs向成骨方向分化。