一種新型真核重組蛋白的制備及其對人膠質瘤干細胞的化療增敏作用

 

　　膠質瘤是人腦最常見的原發性腫瘤,具有極強的增殖和侵襲性,手術切除聯合放化療可顯著延長患者生存期,但復發率仍較高,易產生放化療耐受。

 

　　關于其機制的研究已日漸深入,其中腫瘤干細胞(TSC)假說變得尤為熱門,該假說提出,腫瘤放化療后的復發和轉移可能于其腫瘤干細胞的殘存有很大關系,因而對腫瘤干細胞的深入研究或許能為腫瘤的治療提供新的思路,對研發更有效的抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。

 

　　研究發現,在多數實體腫瘤中Wnt/β-catenin通路的表達異?；钴S,并參與了腫瘤的侵襲和轉移等過程。

 

　　腫瘤干細胞胞核中β-catenin/TCF4轉錄復合體表達的異常增高。

 

　　外部因素刺激后,胞漿中的β-catenin必須穿過細胞膜,進入胞核與轉錄因子4(TCF4)結合才能發揮對下游靶基因的轉錄調控。

 

　　因此,破壞該轉錄復合體的結合可作為干預腫瘤干細胞形成的一個有效途徑。

 

　　目前,已知β-catenin與TCF4的結合位點位于TCF4 N端D的80個氨基酸。

 

　　本課題通過將這前80個氨基酸提取出來構建成分子量20左右的蛋白多肽(命名為NLS-N80-TAT),證實該重組蛋白可作為競爭性抑制劑阻斷TCF4與β-catenin的結合,并抑制TCF/LEF的轉錄活性,抑制膠質瘤干細胞的增殖,并誘導其分化,進而恢復膠質瘤干細胞對化療藥物(替莫唑胺)的敏感性。

 

　　【方法】1、真核重組蛋白NLS-N80-TAT的制備與鑒定(1)NLS-His-FLAG-N80-TAT基因的克隆。

 

　　以pcDNA/Myc-TCF4載體為模板用PCR擴增試劑盒擴增TCF4的前80個氨基酸的序列,在上下游引物中分別引入His-Flag序列和TAT序列,在N端引入NLS序列,得到初級PCR產物,以所述初級PCR產物為模板擴增最終的NLS-His-FLAG-N80-TAT序列。

 

　　(2)HEK293細胞的轉染與表達,將pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N80-TAT通過脂質體轉染試劑轉染HEK293細胞48小時后,新霉素加壓篩選,構建表達NLS-His-FLAG-N80-TAT基因的HEK293穩轉細胞株,通過Western blot檢測NLS-His-FLAG-N80-TAT蛋白的表達。

 

　　(3)NLS-His-FLAG-N80-TAT重組蛋白的分離純化。

 

　　經SDS-PAGE電泳、轉膜后,通過FLAG單克隆抗體對所述的新型真核重組蛋白進行鑒定。

 

　　2、免疫熒光雙染色實驗驗證NLS-N80-TAT可否進入細胞核,免疫共沉淀技術證實NLS-N80-TAT與β-catenin的結合。

 

　　3、免疫共沉淀技術證實NLS-N80-TAT可抑制內源性及外源性β-catenin/TCF4轉錄復合體的結合,熒光素酶報告基因檢測系統檢測不同濃度的NLS-N80-TAT作用下,TCF/LEF通路轉錄的活性。

 

　　4、RT-PCR檢測NLS-N80-TAT對膠質瘤干細胞中標志物CD133表達水平的影響;蛋白質印跡法檢測NLS-N80-TAT對膠質瘤干細胞中增殖相關蛋白(c-Myc)以及分化相關蛋白(β-Ⅲtublin)表達水平的影響;免疫熒光雙染色檢測NLS-N80-TAT對膠質瘤干細胞(β-Ⅲtublin)表達水平的影響【結果】1、NLS-N80-TAT可進入細胞核并與β-catenin相互結合。

 

　　2、NLS-N80-TAT可作為競爭性抑制劑阻礙β-catenin與TCF4的結合,重組蛋白處理組TCF/LEF通路的轉錄活性明顯下降,且有濃度依賴性。

 

　　3、NLS-N80-TAT處理組CD133表達明顯下調,β-Ⅲtublin表達上調。

 

　　4、NLS-N80-TAT聯合化療組較單獨化療組的細胞活力顯著下降。

 

　　【結論】NLS-N80-TAT可作為競爭性抑制劑阻斷TCF4與β-catenin的結合,并抑制TCF/LEF通路的轉錄活性,進而促進膠質瘤干細胞對化療藥物(替莫唑胺)的敏感性,對于其在臨床上膠質瘤的治療具有十分廣闊的應用前景。