目的:Wnt/β-catenin信號通路是一種經典的Wnt信號通路,參與廣泛的生物學過程,諸如細胞分化、增殖、生存、凋亡、黏附、肥大、老化。

 

　　有研究表明,在分化早期階段激活Wnt/β-catenin信號通路可促進小鼠胚胎干細胞向中胚層及心肌細胞分化,然而,Wnt/β-catenin信號通路促心肌細胞分化作用的具體機制仍不清楚。

 

　　活化的Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白的降解減少,大量β-catenin在細胞內聚集,穩定的β-catenin進入細胞核,與Tcf/Lef1轉錄子結合并激活下游靶基因的表達進而調控細胞生理特性,其中Tcf/Lef1家族中包括Tcf1、Tcf3、Tcf4和Lef1。

 

　　因此,本研究主要探討Wnt/β-catenin信號通路中Tcf/Lef1轉錄子在小鼠胚胎干細胞(m ESCs)向心肌細胞分化中的作用。

 

　　方法:首先采用懸浮一步培養法形成擬胚體(EBs),在EBs形成后第2天至第5天加入CHIR99021,命名為CHIR99021組;在EBs形成后第2天至第5天加入Wnt3a,命名為Wnt3a組,將自動分化的EBs命名為對照組。

 

　　采用q RT-PCR法檢測中胚層標志基因Brachyury、心肌前體細胞標志基因Nkx2.5、心肌細胞特異性標志基因α-MHC、c Tn T和Cx43 m RNA的表達。

 

　　運用免疫熒光染色法檢測心肌細胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈(α-MHC)、肌鈣蛋白T(c TNT)及膜聯蛋白43(CX43)的定位表達。

 

　　采用Western blot法檢測α-MHC蛋白相對表達量。

 

　　從而對比分析CHIR99021與Wnt3a在心肌細胞分化中的作用。

 

　　然后使用Piggy Bac vector(PB載體)構建PB-Tcf/Lef1載體以過表達Tcf/Lef1基因,將puromycin加入培養液中以篩選過表達細胞系;采用p LKO.1慢病毒載體構建Tcf/Lef1-sh RNA載體,使用293T細胞進行病毒包被,將獲取的病毒感染小鼠胚胎干細胞,再用puromycin篩選低表達細胞系。

 

　　將獲得的過表達/低表達細胞系通過懸浮一步培養法形成EBs,在EBs形成后的第7天將其貼壁培養,通過倒置顯微鏡觀察其生長狀態,采用q RT-PCR法檢測Brachyury、Nkx2.5、α-MHC、c Tn T和Cx43 m RNA的表達。

 

　　運用免疫熒光染色法檢測心肌細胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈(α-MHC)的定位表達。

 

　　采用Western blot法檢測α-MHC蛋白相對表達量。

 

　　從而對比分析Tcf/Lef1轉錄子在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化中作用。

 

　　結果:通過免疫熒光染色法我們發現胚胎干細胞源擬胚體中有心肌細胞特異性蛋白的定位表達,在CHIR99021和Wnt3a誘導分化過程中,通過q RT-PCR法我們發現Brachyury在分化第7天達高峰,而后逐漸下降;Nkx2.5、α-MHC、c Tn T和Cx43的基因表達量逐漸增加,第15天增加最顯著,且CHIR99021組和Wnt3a組高于對照組;CHIR99021組優于Wnt3a組(*P<0.05,**P<0.01)。

 

　　通過Western blot法我們發現CHIR99021組和Wnt3a組α-MHC蛋白表達量明顯高于對照組,CHIR99021組高于Wnt3a組。

 

　　我們使用PB載體過表達Tcf/Lef1基因,采用p LKO.1慢病毒載體低表達Tcf/Lef1基因,通過q RT-PCR和Western blot發現陽性細胞構建成功。

 

　　隨后我們發現過表達Tcf/Lef1細胞系在分化過程中Brachyury表達量在第7天達高峰,而后逐漸下降;Nkx2.5、α-MHC、c Tn T和Cx43的基因表達量逐漸增加,第15天增加最為明顯,且均高于對照組,其中Tcf1最為顯著(*P<0.05,**P<0.01)。

 

　　通過Western blot法我們發現過表達Tcf/Lef1細胞系在分化過程中心肌細胞標志蛋白α-MHC相對表達量均高于對照組,且Tcf1最為明顯。

 

　　相反,低表達Tcf/Lef1抑制了心肌細胞的分化,尤其是Tcf1的抑制作用較為明顯。

 

　　結論:Wnt/β-catenin信號通路中Tcf1轉錄子可促進小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化,我們的研究將有益于提升胚胎干細胞在治療心血管疾病中發展和應用。